La secuenciación directa de ARN respalda nuevos descubrimientos en biología del ARN

Años de experimentación y bases de datos llenas de resultados de secuenciación de ARN desmienten la simple realidad de que, hasta hace poco, era imposible analizar el ARN directamente. Los estudios de secuenciación de ARN realizados con plataformas de secuenciación tradicionales se basan completamente en ADNc, un proxy imperfecto del ARN que requiere que los científicos infieran conocimientos sobre la molécula de ARN original en lugar de observarla directamente.

Es comprensible que la comunidad científica aceptara este compromiso. El ARN monocatenario es dinámico y altamente estructurado, y se repliega sobre sí mismo de tal manera que resulta imposible para las polimerasas utilizadas en la mayoría de las tecnologías de secuenciación secuenciar el transcrito completo. Secuencias repetitivas, estructuras en horquilla, modificaciones y susceptibilidad a la degradación: el ARN enfrenta muchos desafíos que colectivamente impiden la secuenciación directa.

Si bien cDNA-seq ha sido una heurística necesaria e importante para aprender más sobre el ARN, ya pasó el momento de que los científicos obtuvieran acceso directo. Esto no es sólo sentido común: es el resultado de un informe publicado este año por las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina (NASEM) que pide una iniciativa de 15 años que eventualmente permitirá a los investigadores secuenciar moléculas de ARN. Con todas sus modificaciones intactas.¹ El informe sugiere que el programa podría seguir el modelo del Proyecto Genoma Humano con esfuerzos similares para desarrollar la capacidad de secuenciación de ARN.

El ARN contiene información valiosa que puede ayudar a los científicos a aprender más sobre biología básica, así como sobre los estados de salud versus los estados de enfermedad, información que puede usarse para desarrollar nuevas terapias y vacunas basadas en ARN. En un anuncio sobre el informe NASEM, el presidente de la Academia Nacional de Medicina, Víctor J. "Comprender las modificaciones del ARN y utilizar este conocimiento tiene un inmenso potencial no sólo para la salud y la medicina humanas, sino también para dar forma a todos los seres vivos", afirmó el Dr. Dazau. Sistemas y los productos y tecnologías derivados de ellos.²

Aunque el informe de NASEM inspira nuevos esfuerzos, algunos científicos ya están logrando avances en el análisis de ARN mediante el uso de tecnologías de detección basadas en nanoporos. Las mismas plataformas de nanoporos utilizadas para la secuenciación de ADN también se pueden utilizar con ARN, lo que permite el análisis directo de la molécula sin la necesidad de un paso de conversión de ADNc. Los estudios iniciales basados ​​en este enfoque ya han dado lugar a nuevos hallazgos sobre modificaciones del ARN y ARN no codificantes, así como a la garantía de calidad de las terapias basadas en ARN.

modificación de ARN

Al igual que los cambios epigenéticos observados en el ADN, las modificaciones del ARN son esenciales para el funcionamiento de la molécula. A menudo se eliminan en el proceso de conversión del ADNc, pero el análisis directo del ARN ha permitido por primera vez resolver estas modificaciones en detalle.

Estudios recientes demuestran el poder de caracterizar las modificaciones del ARN. En un estudio de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado, los científicos analizaron modificaciones postranscripcionales en el ARN de transferencia de seis especies diversas, cinco eucariotas y una procariota.³ Utilizando bibliotecas de alto rendimiento para la secuenciación, los científicos generaron una amplia cobertura de moléculas e identificaron 43 modificaciones de ARN diferentes. Estos cambios incluyeron modificaciones mitocondriales específicas en especies eucariotas y conocimiento de las modificaciones del ARNt bacteriano que ocurren durante la infección por bacteriófagos. En general, el equipo informó que este trabajo establece una base sólida para interrogar los ARNt con análisis directo de ARN.

En un estudio de los efectos de los vuelos espaciales en la fisiología humana, investigadores de Weill Cornell Medicine y otras instituciones realizaron una secuenciación directa de ARN en muestras recolectadas de cuatro astronautas en siete momentos diferentes durante el vuelo de tres días que comenzó antes y terminó después de una publicación. . -Período de recuperación del vuelo.⁴ Los resultados del transcriptoma generados a través de RNA-seq resaltan varios cambios en las vías genéticas afectadas por los vuelos espaciales, incluidos cambios en el estrés y las respuestas inmunes. También se encontraron cambios en las modificaciones del ARN: los científicos informaron que el análisis de las modificaciones en las isoformas indicó "un aumento significativo en los niveles de M6A inmediatamente después del vuelo". "Estos datos y resultados representan los primeros perfiles longitudinales de ARN de lectura larga y mapas de modificación de ARN para cada gen para astronautas, lo que mejora nuestra comprensión de la respuesta dinámica del transcriptoma humano a los vuelos espaciales".

ARN no codificante

Los ARN no codificantes, especialmente los ARN largos, han sido particularmente difíciles de analizar con cualquier técnica porque a menudo contienen secuencias muy repetitivas. Sin embargo, con el análisis directo del ARN, los científicos finalmente están desentrañando algunos de los secretos del ARN no codificante.

Por ejemplo, un estudio realizado por científicos de la Universidad de York y el Hospital Universitario St. James en el Reino Unido utilizó secuenciación de ARN directa para analizar muestras resecadas de carcinoma de células renales de células claras, un tipo común de cáncer de riñón.⁵ El grupo de descubrimiento de 12 muestras y el grupo de validación de 20 muestras provinieron originalmente de pacientes que tenían una variedad de resultados de cáncer. En general, el estudio reveló una gran cantidad de datos sobre el ARN que nunca antes se habían visto, incluidas más de 10.000 transcripciones novedosas. Uno de los descubrimientos más interesantes fue un nuevo gen no codificante que se expresaba altamente en pacientes que eventualmente recaían, pero no en otros pacientes.

Los agregados de Huntington interrumpidos por un polímero similar a una proteína rescatan neuronas en un modelo de ratón

Investigadores de la Universidad de Oklahoma estudiaron la respuesta inmune humana a la influenza analizando el ARN en células epiteliales bronquiales. Se centraron en los ARN no codificantes, tanto poliadenilados como no poliadenilados, rastreando los cambios en la expresión y las modificaciones en respuesta a la infección.⁶ Curiosamente, en este proyecto se identificaron dos ARN intergénicos no codificantes largos (linsiRNA) que recientemente se asociaron con respuestas inmunitarias; Ambos lincRNA se metilaron mucho después de la exposición al virus de la gripe. Los pequeños ARN no codificantes también se alteraron después de la infección, lo que resalta varias posibilidades que serán importantes para futuras investigaciones sobre la respuesta inmune al virus.

Control de calidad para terapias de ARN

Si bien la mayoría de los científicos están recurriendo a la secuenciación directa de ARN para ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la biología del ARN en la salud y la enfermedad, el mismo enfoque también se ha utilizado en la investigación aplicada. Con la explosión de interés en las terapias basadas en ARN tras el éxito de las vacunas de ARNm contra la COVID-19, algunos científicos están incorporando el análisis directo de ARN en los procesos de control y garantía de calidad de las terapias y vacunas basadas en ARN.

Por ejemplo, en la Universidad de Queensland y otras instituciones de Australia, los científicos informaron sobre un protocolo de análisis de la calidad de la vacuna de ARNm basado en la secuenciación de nanoporos llamado VAX-seq.⁷ Los métodos de control de calidad típicos utilizados para esta nueva clase de tratamientos tienen altos costos y plazos prolongados, pero según estos científicos, la RNA-Seq directa se puede utilizar para agilizar el proceso.

"VAX-seq puede medir de manera integral los atributos clave de calidad de la vacuna de ARNm, incluida la secuencia, la longitud, la integridad y la pureza", dijeron los investigadores. "Dadas estas ventajas, anticipamos que los métodos RNA-seq, como VAX-seq, serán fundamentales para el desarrollo y la fabricación de fármacos de ARNm".

A medida que más empresas farmacéuticas y de biotecnología se apresuren a desarrollar terapias basadas en ARN, protocolos como VAX-seq serán fundamentales para garantizar que cada tratamiento contenga el contenido de ARN deseado sin ningún contaminante.

mirando hacia adelante

Regularmente se informan nuevos hallazgos basados ​​en análisis directo de ARN en todas las especies, enfermedades, aplicaciones, etc. Al menos algunos de estos resultados mejorarán nuestra comprensión de la biología y otros, en última instancia, permitirán proporcionar mejores tratamientos a los pacientes. A medida que la tecnología subyacente siga mejorando, estas exploraciones del ARN serán aún más profundas y detalladas.

Referencia

1. Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina. 2024. Trazando el futuro de la secuenciación de ARN y sus modificaciones: una nueva era para la biología y la medicina. Washington, DC: Prensa de las Academias Nacionales.
2. Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina. El informe ofrece una hoja de ruta para transformar la comprensión del ARN y la inversión en ciencia y biotecnología del ARNPublicado el 21 de marzo de 2024. Consultado el 7 de octubre de 2024.
3. White LK, Dobson K, del Pozo S, et al. Análisis comparativo de 43 modificaciones de ARN distintas mediante secuenciación de ARNt de nanoporos. biorxivPublicado el 24 de julio de 2024. Consultado el 7 de octubre de 2024. doi:10.1101/2024.07.23.604651.
4. Grigorev K, Nelson TM, Overbay EG, et al. La secuenciación directa de ARN de la sangre de los astronautas revela un aumento de las respuestas transcripcionales hematopoyéticas y de M6A asociadas con los vuelos espaciales. neto. Comuna. 2024; 15: 4950. doi: 10.1038/s41467-024-48929-3.
5. Lee J, Snell EA, Brown J, et al. La secuenciación de ARN de lectura larga redefine el transcriptoma del carcinoma de células renales de células claras y revela nuevos genes y transcripciones asociados con la recurrencia de la enfermedad y la evasión inmune. medRxivPublicado el 8 de septiembre de 2023. Consultado el 7 de octubre de 2024. doi:0.1101/2023.09.08.23295204.
6. Wang D, Booth JL, Wu W, et al. La secuenciación directa de ARN con nanoporos revela cambios inducidos por virus en el panorama transcripcional en células epiteliales bronquiales humanas. biorxivPublicado el 28 de junio de 2024. Consultado el 7 de octubre de 2024. doi:10.1101/2024.06.26.600852.
7. Gunter HM, Idrisoglu S, Singh S, et al. Análisis de calidad de vacunas de ARNm mediante secuenciación de ARN. neto. Comuna. 2023; 14: 5663. doi:10.1038/s41467-023-41354-y.

Libby Snell, PhD, es directora de tecnología de muestras de ARN y ADNc Tecnologías de nanoporos de Oxford,