Método quimioen-enzimético para mejorar el rendimiento y la pureza de SGRNA Triple

Según sus desarrolladores en F. Hoffmann-La Roche y Genentech, sintéticas 100 unidades, ARN de guía única de aligonucleótido (SGRNA), para aumentar tanto la pureza como el rendimiento para ambos SGNS), mejora tanto el enfoque, la pureza y el rendimiento de la quimio-enzimética.

Reciente papelSu método "aprovecha el ensamblaje de la ligaasa-medio de dos piezas de ARN, sintetizadas utilizando cada química estándar de paso sólido" e "implementado, sin modificación, para producir sGRNA de grado GMP para nuestra clínica. East Vivo Terapia de terapia celular. ,

Este proceso utiliza la Ligasa 2 Natural de ARN T4 no ingeniería, que es para sintetizar las piezas de ARN en los objetivos de SGRNA, nota. "Utilizamos una combinación de piezas variables únicas de 49-Mar para cada SGRNA, una sola pieza de 51-Mar fosforilada compartida, y un adaptador de ADN de 29 Mar para todos los SGRNA es común. La combinación unió la pieza de ARN para permitir el ligamento", se desliza deslizándose y declarado por el aning. General,

Para un ensamblaje exitoso que utiliza este proceso, acuñar y el estrés de Sladzevich de que la preparación del tampón es importante. Su equipo usó un tampón acuático que contenía hidroxamemetel aminometano (Tris-HCI), cloruro de magnesio (MGCL 2), detetiotol (DTT) y adenocina 5'-Trocosfato (ATP) en el pH 7.2.

Este enfoque produjo con éxito varios SGRNA diferentes, incluidos SGRNA-412, SGRNA-401, SGRNA-930, SGRNA-467 y SGRNA-463, cada uno de los cuales puede usarse en sistemas CRISPR-CAS para edición o regulación de genes.

Cuando la pureza de HPLC se compara entre el SGRNA producido por SGRNA utilizando este proceso y variedades de vendedor y corte, el análisis mostró que el área SGRNA-412 85.55 (A) era puro, mientras que el vendedor de SGRNA se adquirió de A, mientras que SGRNA se compró de A, y solo 47.26 por%era un%, y un%en 71.12 A era un%de un%. Esa tendencia se aplicó a SGRNA-401, así como al 88.21a% de pureza con un nuevo método, mientras que el vendedor A a solo 46.18 por% en comparación con la versión comercial, y la versión del Vendedor B a 69.47 A% de pureza HPLC. Desarrollado por este nuevo método químico-enzimético para los tres SGRNA restantes (SGRNA-930, SGRNA-467 y SGRNA-463), la pureza se informó a 79.47 un%, 84.45 un%y 84.55 un%respectivamente.

Después de la ligadura, dijo: "El procesamiento aguas abajo consistió en una sola purificación cromatográfica y una fase de ultrafilación estándar, seguida de separación a través de la leopilla.

"Los SGRNA producidos a través del procedimiento se consideran mejor que los largos específicamente sintetizados en el paso sólido", dice Sladosevich y Koenig. "Se están utilizando materiales internos para la fabricación de la terapia celular a través de la edición de genes CRISPR-CAS, y el proceso de revelación se considera fácilmente utilizable para otras funciones de investigación en el área".